肿瘤已经成为危害人类健康的头号杀手，虽然现在治疗肿瘤的方法层出不穷，但是大多数病人的生存状况并没有得到很大的改善。而在肿瘤的各种治疗方法中，化学疗法仍然是最常用的选择。虽然化疗药物应用广泛，但是其对实体肿瘤的治疗效果并不确切。其根本问题是传统化疗药物不能在肿瘤部位达到有效治疗浓度或不能维持足够的作用时间，而且，传统化疗药物对正常细胞的无差别杀伤，导致了多种毒副作用。化疗药物的效果不仅取决于药物的敏感性，还取决于药物在肿瘤部位的作用时间和药物在肿瘤部位的积蓄浓度。故化疗药物的靶向应用，已经成为当今肿瘤化疗研究的热点和难点。

雷帕霉素(rapamycin，rapa)是具有低毒性的强有力免疫抑制剂，通过与相应免疫嗜素rmbp结合抑制细胞周期g0期和g1期，阻断g1进入s期而发挥作用，广泛应用于移植手术中。雷帕霉素除了免疫抑制作用，还有抗肿瘤作用，能够浓度依赖性抑制肾癌、淋巴瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、神经内分泌癌和胃癌等肿瘤细胞的生长。2007年起，雷帕霉素的两种衍生物坦罗莫司和依维莫司开发用于治疗癌症，雷帕霉素在肿瘤治疗方面的研究及应用日益增多，单独应用或联合用药在体外、体内均表现显著的抗肿瘤效果。rapa通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)受体，影响其转导的多种信号通路，从而发挥抗血管生成、阻滞细胞周期和促进细胞凋亡等多种作用，对肿瘤的增殖、侵袭和转移等过程产生影响。但雷帕霉素属于疏水性药物，不能直接用于注射，雷帕霉素的体内生物利用度很低，易造成未到达病症部位就已经失效的问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种雷帕霉素制剂，该雷帕霉素制剂可对肿瘤细胞具有很好的亲和力和靶向性，通过定位到肿瘤细胞，使雷帕霉素在肿瘤细胞中富集，提高肿瘤组织对雷帕霉素的摄取率，从而使肿瘤细胞发生凋亡，治疗肿瘤。

本发明的第二个目的在于提供上述雷帕霉素制剂的制备方法，制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

本发明的第三个目的在于提供上述雷帕霉素制剂的制备方法，制备脂肪乳的雷帕霉素制剂。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种雷帕霉素制剂，包括按重量份计的以下有效成分：

雷帕霉素1-100份；

磷脂1-2000份；

稳定剂0.01-100份。

进一步地，雷帕霉素制剂还包括冻干保护剂0.01-20000份。

进一步地，冻干保护剂为乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的至少一种。

进一步地，磷脂为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、二磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。

进一步地，卵磷脂为大豆卵磷脂和氢化大豆卵磷脂中的至少一种。

进一步地，稳定剂为胆固醇、胆固醇硫酸酯钠、多烯酸乙酯、甘油和泊洛沙姆中的至少一种。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种雷帕霉素制剂的制备方法，包括：

混合步骤：将雷帕霉素、磷脂和稳定剂以有机相溶剂溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液滴加入水相溶剂中，温度≤40℃的条件下搅拌30-150min，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液均质后，加入冻干保护剂混合，经微孔滤膜过滤除菌，灭菌，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

进一步地，冻干步骤中，以0.22-0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌。

实现本发明的第三个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种雷帕霉素制剂的制备方法，包括，

混合步骤：将雷帕霉素和磷脂以有机相溶剂溶解，然后旋蒸去除非油相物质，得到初混合液；

初乳溶液制备步骤：在水相溶剂中加入稳定剂，然后将初混合液加入，搅拌形成初乳溶液；

ph调节步骤：调节初乳溶液的ph为8-9，然后均质，得到脂肪乳的雷帕霉素制剂。

进一步地，初乳溶液制备步骤中，搅拌速度为300-1200rpm。

进一步地，ph调节步骤中，以0.1mnaoh溶液调节ph；均质的压力为300-1000bar。

进一步地，有机相溶剂为无水乙醇、二氯甲烷、叔丁醇、丙酮、甲醇、大豆油、中链甘油三酯和油酸中的至少一种。

进一步地，水相溶剂为蒸馏水、生理冲液、细胞培养液、体液和缓冲液中的至少一种。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明雷帕霉素制剂可对肿瘤细胞具有很好的亲和力和靶向性，通过定位到肿瘤细胞，提高肿瘤组织对雷帕霉素的摄取率，从而使肿瘤细胞发生凋亡，治疗肿瘤；

2、本发明雷帕霉素制剂限定了磷脂的用量，磷脂的量影响雷帕霉素的包封率，磷脂成分太高，会浪费原料，且导致载药量降低，磷脂成分太低，会导致雷帕霉素包封不完全；稳定剂在区间用量内，可以使脂质体最稳定且副作用最少；

3、本发明雷帕霉素制剂的制备方法，将雷帕霉素制备为脂质体冻干粉和脂肪乳，具有稳定的包封率和载药量，可以提高雷帕霉素在肿瘤细胞的浓度，降低其对正常细胞的毒副作用；

4、本发明雷帕霉素制剂的制备方法中，初乳溶液制备温度控制在40℃以内，若温度高于40℃时，磷脂会被破环；搅拌时间控制在30-150min，时间过短，搅拌不均匀，制备的脂质体粒径偏大，包封率过低，搅拌时间过长，雷帕霉素会释出，导致脂质体制备不成功。

附图说明

图1为实施例1-4的制剂外观示图；

图2为实施例1-4的制剂溶解后外观示图；

图3为脂质体的雷帕霉素制剂颗粒模拟图；

图4为雷帕霉素制剂的粒径分布图；

图5为雷帕霉素制剂的tem图；

图6为雷帕霉素制剂的zeta电位图；

图7为雷帕霉素制剂对细胞的抑制效果图；

图8为肿瘤细胞对脂质体的雷帕霉素制剂的摄取率；

图9为克隆集落的示意图；

图10为肿瘤细胞凋亡的示意图；

图11为肿瘤细胞迁移示意图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

1)制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

具体步骤如下：

混合步骤：将雷帕霉素、磷脂和稳定剂以有机相溶剂溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入水相溶剂中，温度≤40℃的条件下搅拌30-150min，搅拌速度为300-1200rpm，得到初乳溶液；初乳溶液中，雷帕霉素的浓度为1-100mg/100ml，磷脂1-2000mg/100ml，稳定剂0.01-100mg/100ml；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质5-20次，均质压力为300-1000bar，然后加入冻干保护剂混合，冻干保护剂的浓度为0.01-20000mg/100ml，经0.22-0.45μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥或高压灭菌，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂，其平均粒径为10-200nm，载药量为1-40％，包封率为85％以上。

冻干保护剂为乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖和海藻糖中的至少一种。

该制剂具有高度的分散性，表面积巨大，有利于增加药物与吸收部位生物膜的接触时间和接触面积，增加药物的溶解性；可通过内吞机理进入细胞，与一般药物的跨膜转运机理不一样，所以可增加药物对生物膜的透过率。

脂质体是由脂质体双分子层形成的一种纳米级载体制剂，脂质体双分子层可以包裹脂溶性和水溶性药物，另外，脂质体具有良好的生物相容性，可以被正常代谢。脂质体本质上是一种磷脂类物质，对肿瘤细胞具有很好的亲和力，通过肿瘤细胞对其的高摄取能力，提高药物在肿瘤细胞里面的含量，从而达到是药物在肿瘤细胞富集，治疗肿瘤的效果。与其它载药系统相比，脂质体具有一定的靶向性、对肿瘤细胞的亲和力，延长药物作用时间、降低药物毒性以及保护被包封药物等多种优点。

本发明通过两亲性磷脂的包裹作用以及有机相溶剂的助溶和分散作用，最后在水相溶剂中形成脂质体的纳米粒子结构。该脂质体型纳米粒子结构提高了雷帕霉素在水相中的溶解度，提高肿瘤细胞对其的摄取率，并具有一定的缓释作用和靶向作用，可提高雷帕霉素的治疗效果。本发明提供的雷帕霉素制剂为纳米脂质体结构，具有均一且稳定的粒径分布，稳定的包封率和载药量，对血管风险小；该雷帕霉素制剂具有稳定的包封率和载药量，具有较佳的肿瘤靶向作用；该雷帕霉素制剂通过使肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤。

2)制备脂肪乳的雷帕霉素制剂：

具体步骤如下：

混合步骤：将雷帕霉素和磷脂以有机相溶剂溶解，然后旋蒸去除非油相物质，得到初混合液；

初乳溶液制备步骤：在水相溶剂中加入稳定剂，然后将初混合液加入，搅拌速度为300-1200rpm，搅拌时间30min，形成初乳溶液；初乳溶液中，雷帕霉素的浓度为1-100mg/100ml，磷脂1-2000mg/100ml，稳定剂0.01-100mg/100ml；

ph调节步骤：以0.1mnaoh溶液调节初乳溶液的ph为8-9，然后均质3-10次，均质的压力为300-1000bar，得到脂肪乳的雷帕霉素制剂，其平均粒径为10-1000nm，载药量为1-40％，包封率为85％以上。

制备脂质体冻干粉和制备脂肪乳的雷帕霉素制剂的成分中：

磷脂为卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、二磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的至少一种。其中卵磷脂可使用氢化大豆卵磷脂，氢化大豆卵磷脂的使用可以使脂质体更加稳定。

稳定剂为胆固醇、胆固醇硫酸酯钠、多烯酸乙酯、甘油和泊洛沙姆中的至少一种。

有机相溶剂为无水乙醇、二氯甲烷、叔丁醇、丙酮、甲醇、大豆油、中链甘油三酯和油酸中的至少一种。

水相溶剂为蒸馏水、生理冲液、细胞培养液、体液和缓冲液中的至少一种。

脂质体冻干粉和脂肪乳雷帕霉素制剂的使用方式为：加入注射用液体，如注射用生理盐水，注射用葡萄糖溶液或注射用糖盐溶液，混匀得到一定浓度的注射液，注射液中雷帕霉素的浓度一般为5-100mg/100ml。

实施例1：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素5mg、氢化大豆卵磷脂40mg和胆固醇(稳定剂)3.75mg以二氯甲烷(有机相溶剂)3ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入pbs(水相溶剂)40ml中，温度≤40℃的条件下搅拌60min，搅拌速度为600rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质6次，均质压力为900bar，然后加入乳糖(冻干保护剂)2g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例2：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素50mg、磷脂450mg和胆固醇(稳定剂)50mg以二氯甲烷(有机相溶剂)10ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入pbs(水相溶剂)100ml中，温度≤40℃的条件下搅拌60min，搅拌速度为600rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质6次，均质压力为900bar，然后加入乳糖(冻干保护剂)5g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例3：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素50mg、磷脂450mg和胆固醇(稳定剂)50mg以二氯甲烷(有机相溶剂)10ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入pbs(水相溶剂)100ml中，温度≤40℃的条件下搅拌60min，搅拌速度为600rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质6次，均质压力为900bar，然后加入海藻糖(冻干保护剂)5g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例4：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素240mg、氢化大豆卵磷脂2160mg和胆固醇(稳定剂)240mg以二氯甲烷(有机相溶剂)20ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入蒸馏水(水相溶剂)300ml中，温度≤40℃的条件下搅拌90min，搅拌速度为550rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质5次，均质压力为600bar，然后加入乳糖(冻干保护剂)15g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例5：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素240mg、氢化大豆卵磷脂2160mg和胆固醇(稳定剂)240mg以二氯甲烷(有机相溶剂)20ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入蒸馏水(水相溶剂)300ml中，温度≤40℃的条件下搅拌90min，搅拌速度为550rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质5次，均质压力为600bar，然后加入海藻糖(冻干保护剂)15g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例6：

制备脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂：

混合步骤：将雷帕霉素800mg、氢化大豆卵磷脂7200mg和胆固醇(稳定剂)800mg以二氯甲烷(有机相溶剂)100ml溶解，得到有机相混合液；

初乳溶液制备步骤：将有机相混合液以1-10滴/min的速度加入蒸馏水(水相溶剂)1000ml中，温度≤40℃的条件下搅拌90min，搅拌速度为600rpm，得到初乳溶液；

冻干步骤：将初乳溶液在均质机上均质6次，均质压力为850bar，然后加入海藻糖(冻干保护剂)50g混合，经0.22μm孔径的微孔滤膜过滤除菌，冷冻干燥，得到脂质体冻干粉的雷帕霉素制剂。

实施例7：

制备脂肪乳的雷帕霉素制剂：

具体步骤如下：

混合步骤：将雷帕霉素10mg和氢化大豆卵磷脂200mg(氢化大豆卵磷脂先以无水乙醇2ml溶解)以中链甘油三酯1g、油酸0.5ml、大豆油1ml(有机相溶剂)溶解，然后旋蒸去除非油相物质无水乙醇，得到初混合液；

初乳溶液制备步骤：在蒸馏水(水相溶剂)6.5ml中加入泊洛沙姆18820mg、甘油1ml(稳定剂)并加热至60℃，然后将预热至60℃的初混合液加入，搅拌速度为600rpm，搅拌时间30min，形成初乳溶液，再加入93.5ml的蒸馏水(水相溶剂)；

ph调节步骤：以0.1mnaoh溶液调节初乳溶液的ph为8-9，然后均质4次，均质的压力为850bar；

得到脂肪乳的雷帕霉素制剂。

实施例8：

制备脂肪乳的雷帕霉素制剂：

具体步骤如下：

混合步骤：将雷帕霉素30mg和氢化大豆卵磷脂900mg(氢化大豆卵磷脂先以无水乙醇2ml溶解)以中链甘油三酯7.5g、油酸0.18ml(有机相溶剂)溶解，然后旋蒸去除非油相物质无水乙醇，得到初混合液；

初乳溶液制备步骤：在蒸馏水(水相溶剂)21ml中加入泊洛沙姆18812mg、甘油0.9ml(稳定剂)并加热至60℃，然后将预热至60℃的初混合液加入，搅拌速度为600rpm，搅拌时间30min，形成初乳溶液，再加入79ml的蒸馏水(水相溶剂)；

ph调节步骤：以0.1mnaoh溶液调节初乳溶液的ph为8-9，然后均质10次，均质的压力为400bar；

得到脂肪乳的雷帕霉素制剂。

实施例9：

制备脂肪乳的雷帕霉素制剂：

具体步骤如下：

混合步骤：将雷帕霉素30mg和氢化大豆卵磷脂900mg(氢化大豆卵磷脂先以无水乙醇2ml溶解)以中链甘油三酯3.5g、油酸0.18ml、大豆油3.5ml(有机相溶剂)溶解，然后旋蒸去除非油相物质无水乙醇，得到初混合液；

初乳溶液制备步骤：在蒸馏水(水相溶剂)21ml中加入泊洛沙姆18812mg、甘油0.9ml(稳定剂)并加热至60℃，然后将预热至60℃的初混合液加入，搅拌速度为600rpm，搅拌时间30min，形成初乳溶液，再加入79ml的蒸馏水(水相溶剂)；

ph调节步骤：以0.1mnaoh溶液调节初乳溶液的ph为8-9，然后均质10次，均质的压力为400bar；

得到脂肪乳的雷帕霉素制剂。

检测：

1)外观评价、平均粒径、电位和包封率的测定

对实施例得到的雷帕霉素制剂进行外观评价、平均粒径、电位、包封率、过氧化值和有机溶剂残留量的测定；

其中，外观评价标准：以维持原体积，不坍陷，不皱缩，色泽均匀，无花斑，质地细腻为佳，如图1所示，溶解后不分层，如图2所示；图1和图2自左至右依次为实施例1-4的制剂。

平均粒径：采用马尔文激光粒度仪测定纳米粒的粒径及粒径分布，其原理为利用粒子被光照射时发生光散射以及光发生衍射的特征，并光的散射强度和衍射强度与粒子大小以及光学特征有关的原理来测定粒子大小。

过氧化值：根据2015版《中国药典》中过氧化值的检测方法，分别检测实施例1、3、5脂质体中的过氧化值，分别为0.86meq/kg，0.85meq/kg，0.86meq/kg，符合药典要求。

有机溶剂残留量：根据2015版《中国药典》中有机溶剂残留量的检测方法，检测实施例4中有机溶剂残留量，为0.055％，符合药典要求。

图3为实施例4的脂质体的雷帕霉素制剂模拟图，其中球状物为有效成分雷帕霉素，图4为雷帕霉素制剂的粒径分布图；图5为雷帕霉素制剂的tem图。

电位：采用马尔文激光粒度仪测定纳米粒电位；图6为雷帕霉素制剂的zeta电位图。

参照含量测定项方法，测定药物总含量。

药物含量采用高效液相色谱法测定，以甲醇-乙腈-水(体积比为43:40:17)为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长为278nm。

包封率计算公式为：包封率＝包封的药量/主药总含量×100％

表格1实施例1-9的再分散性、包封率和平均粒径

由表格1可知，本申请得到的雷帕霉素制剂的包封率在85％以上。

2)细胞毒性实验使用mtt试剂盒法以及hct116细胞进行细胞毒性实验，hct116细胞以1×104个/孔的接种量接种于96孔板中5％co237℃培养箱中培养24小时，分别给予浓度(以雷帕霉素有效成分计)为80μg/ml、40.00μg/ml、30.00μg/ml、20.00μg/ml、10.00μg/ml、5.00μg/ml、2.50μg/ml、1.25μg/ml、0.65μg/ml、0.3125μg/ml和0μg/ml的实施例4(rl1)和实施例8(rl2)的雷帕霉素制剂分别处理48h后，雷帕霉素制剂明显抑制hct116细胞的生长，如图7所示，给药48h的ic50为11.68μg/ml。

3)脂质体的雷帕霉素制剂的细胞摄取实验

将处于对数生长期的hct116细胞按每孔2ml约2×104个/孔的细胞密度接种于六孔板中，于饱和湿度的细胞培养箱中37℃，5％co2培养48h。用pbs洗3次，于细胞中分别加入含中浓度为8ug/ml雷帕霉素(r组)和8ug/ml实施例5脂质体的雷帕霉素制剂(rl组)含1％胎牛血清的dmem细胞培养液，分别孵育30min、60min、90min和120min后，裂解细胞，提取裂解液，按bca法测定各孔细胞内蛋白浓度。用lc-ms法测定hct116细胞对雷帕霉素的摄取。质谱条件检测离子对：雷帕霉素936.47/936.47(ce:11v；tubelensvoltage:96.54v)；内标达那唑338.32/338.32(ce:15v；tubelensvoltage:106.11v).色谱分离条件：0-2min80％甲醇；2-3min95％甲醇；3-6min95％甲醇；6-7min80％甲醇，分析时间10min，进样量：10ul，色谱柱：agilentsb-c182.1×100nm3.5um。结果图8显示，在不同时间点，肿瘤细胞对脂质体的雷帕霉素制剂的摄取率都远远高于原料药，证明脂质体的雷帕霉素制剂对肿瘤细胞具有很强的亲和力和靶向性，很好地体现了该纳米制剂的性能远远优于原料药。

4)脂质体的雷帕霉素制剂的体外抑瘤效果

4.1平板克隆实验检测肿瘤细胞增殖实验

取对数生长期的hct116细胞和sw-480细胞，用10％胎牛血清的细胞培养液制成悬液，并吹打成单个细胞，计数，以1×103个/孔的密度接种于六孔板中，置于5％co237℃及饱和湿度的细胞培养箱中培养至细胞贴壁后，实验分为3组：未处理组(control组)，游离雷帕霉素组(r组)，脂质体的雷帕霉素组(rl组，使用实施例3)。给药后，经常观察，当出现肉眼可见的克隆球时，终止细胞培养，弃去细胞液，用pbs缓冲液浸洗2次，加入1ml4％多聚甲醛固定20min。移去固定液后，pbs缓冲液洗3次，加入1％结晶紫染色液染色30min后，用流水缓慢冲洗去除染色液，于37℃烘箱烘干，拍照计数。克隆形成率＝(细胞克隆数/接种细胞数)×100％。结果显示，与未处理组相比，脂质体的雷帕霉素组能明显减少人结肠癌细胞hct116和sw-480的克隆集落数。经过对每组克隆集落数的计算，如图9所示，各组的hct116细胞中的克隆集落数为62.0±7.6，49.2±5.2，33.1±7.3，脂质体的雷帕霉素组明显低于游离雷帕霉素组(p<0.01)。各组的sw-480细胞中的克隆集落数为36.1±7.5，33.2±3.7,22.5±4.6，脂质体的雷帕霉素组明显低于游离雷帕霉素组(p<0.01)。

4.2流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡

采用细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡，实验分为3组：未处理组(control组)，游离雷帕霉素组(r组)，脂质体的雷帕霉素组(rl组，使用实施例1)。给药48h后，移除各组细胞液，用1×pbs洗3次，无edta胰酶消化2min，10％胎牛血清细胞培养液终止消化，收集细胞于离心管，1000rpm离心3min，1×pbs(4℃)洗2次，在400ulannexinv结合液中悬浮，然后加入5ulannexinv-fitc染色液，在黑暗中孵育15min。然后加入pi染色液10ul，在黑暗中孵育5min。立即用流式细胞仪检测。结果发现，在hct116细胞中，未处理组，游离雷帕霉素组，脂质体的雷帕霉素组细胞凋亡率分别是16％，21％，37％。与未处理组相比，脂质体的雷帕霉素组凋亡率明显增加(p<0.05)，结果见图10。

4.3迁移实验检测肿瘤细胞迁移能力

取对数生长期的hct116细胞和sw-480细胞，用无血清的细胞培养液制成悬液，计数，将细胞悬液做倍数稀释，加入含药物浓度为15ug/ml的无血清细胞培养液，然后以1×105个/孔的密度接种200ul于transwell小室的上室中，于transwell小室的下室加入500ul10％胎牛血清的细胞培养液，置于5％co237℃及饱和湿度的细胞培养箱中培养36h后，观察穿过小室的细胞数量，用棉签轻轻擦去上室细胞。下室细胞用甲醛固定15min后，用1％结晶紫溶液染色30min，于显微镜下观察拍照计数。如图11所示，在hct116细胞中，未处理组(control组)，游离雷帕霉素组(r组)，脂质体的雷帕霉素组(rl组)穿过小室的细胞百分数为100.0±12.5，77.6±10.9，64.7±8.3。脂质体的雷帕霉素组明显少于游离雷帕霉素组(p<0.01)。在sw-480细胞中，未处理组，游离雷帕霉素组，脂质体的雷帕霉素组穿过小室的细胞百分数为100.0±11.7，57.4±10.6，42.9±12.3。脂质体的雷帕霉素组明显少于游离雷帕霉素组(p<0.05)。

由图11可知，本申请的制剂能促进肿瘤细胞凋亡，明显抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。